PORTARIA N° 04/94 DE 26 DE JANEIRO DE 1994
O SECRETÁRIO DE SAÚDE DO DISTRITO FEDERAL, no uso de suas atribuições regimentais, RESOLVE:
1. Aprovar, no âmbito da Secretaria de Saúde do Distrito Federal, a Padronização do Teste de Sensibilidade à Antimicrobianos na forma do Manual de Procedimentos em anexo, elaborado pela Comissão Técnica constituída pela Portaria de 04 de junho de 1993.
2. A presente Portaria entra em vigor sessenta dias a partir da data de sua publicação, revogando as disposições em contrário.
Brasília, 26 de janeiro de 1994.
INSTITUTO DE SAÚDE DO DISTRITO FEDERAL
PADRONIZAÇÃO DO TESTE DE SENSIBILIDADE À ANTIMICROBIANOS
GOVERNO DO DISTRITO FEDERAL
APRESENTAÇÃO
Este manual tem como objetívo padronizar as técnicas laboratoriais a serem utilizadas no Teste de Sensibilidade à Antimicrobianos, pelas diferentes Unidades de Saúde que trabalham com cultura bacteriana no âmbito da Secretaria de Saúde do Distrito Federal.
A Comissão Técnica designada pela Portaria de 04 de junho de 1993 da Secretaria de Saúde, coordenou a organização do texto ora apresentado, de que participaram ativamente todos os seus integrantes, a saber:
Lúcia Regina Ferraz - Coordenadora (ISDF);
Adília Jane de Alcântara Segura (FHDF/HBDF);
António Leitão Torres de Araújo (ISDF);
Ely Mendes Ferreira (FHDF/HRT);
Julival Fagundes Ribeiro (FHDF/CCIH);
Maurício Rolo Filho (FHDF/HRG);
Vera Lúcia Ferreira Amorim (FHDF/HBDF).
SUMÁRIO
2 - ORGANIZAÇÃO E ATRIBUIÇÕES DOS LABORATÓRIOS
2.1 - Comissão Técnica para Microbiologia do SUS-DF
2.2 - Laboratório Central de Referência do SUS-DF
3 - TESTES DE SENSIBILIDADE A DROGAS ANTTMICROBIANAS PELO MÉTODO DA DIFUSÃO EM ÁGAR (ANTEBIOGRAMA)
3.2 - Preparação e Estocagem do Meio
3.3 - Estocagem de Discos Antimicrobianos
3.4 - Preparação do Inoculo 35 - Semeadura em Placas
3.7 - Leitura das Placas e Interpretação dos Halos de Inibição
3.8 - Antibiograma de Organismos Exigentes
4 - COEFICIENTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
4.2 - Cálculo e Interpretação do Coeficiente de Sensibilidade
. ANEXO l : Formulário para Encaminhamento de Amostras
. ANEXO 2 : Mapa Bacteriológico dos Pacientes Internados
. ANEXO 3 : Tabela para Cálculo do Coeficiente de Sensibilidade
. ANEXO 4 : Fórmulas de Meios de Cultura
.ANEXO 5 : Escala de Mac Farland
1 - INTRODUÇÃO
A necessidade constante de um acompanhamento dos procedimentos laboratoriais utilizados em bacteriologia, visando o aprimoramento técnico, aliado ao permanente trabalho realizado pela COH - Comissão de Controle de Infecção Hospitalar, gerou a necessidade de se promover um estudo mais aprofundado na realização e padronização do antibiograma.
O presente manual contempla a padronização dos procedimentos técnicos do teste de sensibilidade bacteriana aos antímicrobianos "in vitro" , para que os resultados assim obtidos se correlacionem melhor com a resposta terapêutica observada na prática clinica.
Este trabalho e outros na área de bacteriologia, devem ser continuamente aprimorados para que isto possa se refletir na melhoria da qualidade da assistência prestada, na forma de alertar aos profissionais de saúde quanto ao aparecimento constante de cepas bacterianas resistentes aos antímicrobianos.
2 - ORGANIZAÇÃO E ATRIBUIÇÕES DOS LABORATÓRIOS
O presente fluxograma contempla os diversos serviços em diferentes níveis de complexidade. Deverá ser constituída paralelamente a implantação deste trabalho, uma Comissão Técnica para Microbiologia Clínica.
2.1 - Comissão Técnica para Microbiologia do SUS-DF.
A Comissão Técnica será constituída por profissionais de nível superior com notório compromisso de trabalho com a Microbiologia Clínica.
A Comissão Técnica contará, entre seus membros, com profissionais indicados pelo ISDF, pelo DRMA-FHDF e outros profissionais a nível de SUS.
A Comissão Técnica funcionará como órgão coordenador nas atividades específicas para exames microbiológicos.
É da competência da Comissão Técnica no presente trabalho:
- Atuar junto aos setores envolvidos visando a qualidade dos testes de sensibilidade aos antimicrobianos;
- Prestar assessoria técnica e participar na supervisão dos laboratórios;
- Viabilizar o intercâmbio entre as instituições envolvidas.
2.2 -Laboratório Central de Referencia do SUS-DF.
O ISDF através da Gerência de Biologia Médica será o Laboratório Central de Referenda com as seguintes atribuições:
- Enviar amostras a Centros de Referencia Nacionais;
- Remeter cepas controles trimestralmente aos laboratórios participantes;
- Remeter cepas padrões aos laboratórios participantes, sempre que necessário;
- Analisar os resultados do Controle de Qualidade enviados i participantes com posterior retomo da avaliação às Unidades de origem e à Comissão Técnica a ser constituída;
- Treinar recursos humanos e promover reuniões técnicas;
- Promover supervisão com assessoria da Comissão Técnica.
23.1 - Laboratórios de Referenda.
Para efeito desta padronização são identificados a seguir, os Laboratórios de Referencia com suas respectivas áreas de cobertura:
- Hospital Regional da Asa Norte
- Hospital Regional de Sobradinho
- Hospital Regional da Ceilândia
- Hospital Regional de Planaltina
- Laboratório Regional da Ceilândia
- Hospital Regional de Taguatinga
- Laboratório Regional do Guará
São as seguintes as competentias dos Laboratórios de Referendas:
- Receber e manter cepas bacterianas previamente isoladas e indentificados como multiresistentes;
- Realizar testes adicionais necessários à confirmação da identificação e multiresistência das cepas;
- Enviar cepas confirmadas com perfil de sensibilidade alterada ao Laboratório Central de Referencia;
- Apoiar a realização de cursos e treinamentos técnicos promovidos pela Comissão Técnica;
- Atuar juntamente com o Laboratório Central de Referência na Supervisão técnica dos Laboratórios Locais;
- Retornar aos Laboratórios Locais o resultado das cepas enviadas.
23.2 - Laboratórios Locais da Fundação Hospitalar do Distrito Federal.
São os Laboratórios especificados acima, inclusive os Laboratórios de Referência, com as seguintes atribuições:
- Executar rotinas microbiológicas que permitam o isolamento e a identificação dos principais agentes infecciosos de importância clínica, por género e, se possível, por espécie;
- Realizar antibiograma dentro dos padrões preconizados pelo presente manual;
- Enviar as cepas de resistência alterada aos Laboratórios de Referência, acompanhadas de formulário segundo modelo constante no Anexo l, devidamente preenchido;
- Designar um profissional de nível superior com formação em Microbiologia como responsável pelos contatos com os Laboratórios de Referência e Laboratório Central;
- Designar profissionais de nível superior e médio, que trabalhem no setor de Microbiologia, para fazer treinamento e/ou reciclagem sempre que necessário;
- Designar um profissional de nível superior do setor de Microbiologia para elaborar um relatório diário de andamento das culturas de pacientes internados, bem como calcular mensalmente o coeficiente de sensibilidade das cepas isoladas, remetendo dados a CC1H local (Anexos 2 e 3);
- Processar as cepas controle enviadas pelo Laboratório Central e remeter os resultados ao mesmo, dentro do prazo de uma semana.
24.1 - Laboratório de Hospitais Públicos, Militares e Privados.
Este programa poderá ser implantado nestas instituições através de entendimentos com a Comissão Técnica para sua viabilização.
3 - TESTES DE SENSIBILIDADE A DROGAS ANTIMICROBIANAS PELO MÉTODO DA DIFUSÃO EM ÁGAR (ANTIBIOGRAMA).
Embora existam numerosos métodos para a realização do teste de sensibilidade a antímicrobianos (TSA), a técnica de difusão com disco (método de Kirby-Bauer) é o sistema mais amplamente utilizado, por estar padronizado, ser prático e seguro. Uma vantagem adicional do método é a apresentação de resultados alternados em «sensível», «intermediário» e «resistente», permitindo interpretação e correlação com os dados de concentração inibitória mínima (CIM), e com os níveis antimicrobianos aferidos no sangue e na urina.
O método de difusão com disco foi padronizado pelo National Commitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) para patógenos de crescimento rápido, como a família das Enterobactérias, o Staphylococcus ourais e as Pseudomonas spp. Há ainda estudos insuficientes para desenvolver padronização adequada de TSA de alguns microorganismos mais lentos e exigentes em seu crescimento, requerendo uma atmosfera anaeróbica ou microaerófila. As provas com discos para HaemophUus influenzae, Neisseria gonarrhoeae e Streptococcus pneumonias, já se encontram padronizados para alguns antimicrobianos, e serão descritos posteriormente.
3.2 - Preparação e estocagem dos meios de cultura:
Meios de cultura preparados e estocados inadequadamente podem originar grande variação nos resultados do TSA. Por exemplo, placas antigas e desidratadas promovem diminuição de difusão de alguns agentes, alterando em até mais de 10% os resultados. Um erro de 30% pode ser produzido pelo ágar de profundidade inadequada, e variação de 8% pode resultar na alteração em cada unidade do pH do meio.
1°) O ágar Mueller-Hinton (MH) deve ser preparado de acordo com as recomendações do fabricante. (Anexo 4).
2°) O pH de cada partida de ágar MH deve ser verificado quando da preparação do meio. O ágar deve ter ao final da preparação um pH de 7,2 a 7,4, à temperatura ambiente.
3°) Colocar de 60 a 70 ml do meio recém-preparado em placas de Petri de 150 x 20mm ou 25 a 30 ml em placas de Petri de 100 x 20 mm para se obter a profundidade uniforme de 4 mm. Aguardar solidificar à temperatura ambiente sob uma superfície plana.
4°) A menos que venham a ser usadas no mesmo dia, as placas devem ser estocadas no refrigerador (2 a 8ºC), envoltas em sacos plásticos e usadas até sete dias após sua preparação.
5°) Antes do uso, as placas devem ser mantidas a 35°C até perder pela evaporação, a umidade da superfície. Não devem haver gotas de umidade na superfície do meio, ou na tampa da placa de Petri, por ocasião da semeadura.
1°) Cinco ml de caldo Mueller-Hinton (MH) devem ser colocados em tubos de 13 x lOOmm, de preferencia com tampa rosqueável, que serão, depois, autoclavados (Anexo 4).
2°) Todo caldo MH contendo predpitado branco deve ser descartado, uma vez que o precipitado interfere com as leitoras de turvação.
3.3 - Estocagem de discos antimicrobianos:
a) Quando recebidos, os discos devem ser divididos em coleções de trabalho e conservados a 4ºC, ou menos, com o dissecante nos frascos originais. Somente uma coleção de trabalho, a cada vez, deve ser removida do refrigerador ou "freezer".
b) Para evitar a condensação nos discos antes de serem usados, os frascos fechados devem ser removidos do refrigerador ou "freezer" e abertos somente quando atingirem a temperatura ambiente.
A preparação exata do inoculo é um dos mais importantes objetivos do controle de qualidade: a variação da concentração do inoculo pode resultar em erros superiores a 50%.
a) Da cultura pura, selecionar 5 a 10 colônias e transferir este inóculo para um tubo de 13 x lOOmm, contendo 5ml de caldo MH.
b) Incubar o tubo à 35°C de forma que, quando agitado, a suspensão de microorganismos fique com turvação visualmente igual à da solução padrão de sulfato de bário (0,5 ml de BaO2 a 1%, adicionado a 99,5ml de H2SO4 a 1% ou 0.36N). Esta turbidez é conhecida como padrão de turvação 0,5 da escala de Mac Farland (Anexo 5). Os tubos com a solução padrão devem ser conservados no escuro, à temperatura ambiente e preparado semestralmente. Para ajustar a densidade do inóculo poderá utilizar-se um fundo branco e uma linha negra contrastante em combinação com uma fonte de luz. A calibração se faz pelo processo de comparação da turvação dos tubos (padrão e inóculo). O inóculo deve ser semeado no meio de cultura no prazo máximo de 15 minutos após a calibração.
a) Devem ser usados «swabs» ou zaragatoas de algodão com aplicador de madeira ou plástico, esterilizado em autoclave.
b) Mergulhar o «swab» estéril no caldo com o inóculo ajustado. Retirar o excesso de líquido, pressionando contra a parede do tubo.
c) Obtém-se um inóculo homogêneo, passando o «swab» sobre toda superfície do ágar, sucessivamente, em três eixos diferentes. Se a placa for satisfatoriamente semeada, as zonas de inibição serão uniformemente circulares.
a) Placas inoculadas não devem ser previamente incubadas, antes da aplicação dos discos.
b) O lote apropriado de discos é removido do refrigerador para ajustar-se à temperatura ambiente.
c) A escolha dos discos a serem testados deve estar de acordo com a padronização de antimicrobianos do hospital.
d) Recomenda-se que um lote padrão de discos seja usado para cada grupo de bactérias, de acordo com as sugestões da Tabela 3. Embora nem todos antimicrobianos testados sejam necessariamente empregados em tratamentos das infecções, os padrões de sensibilidade anotados são de grande importância no reconhecimento dos surtos, na detecção de infecções cruzadas e na condução de investigações epidemiológicas. Permitem também efetuar análise dos padrões de sensibilidade das bactérias mais frequentemente isoladas no hospital.
e) Os discos são aplicados à superfície do ágar por meio de pinça estéril. A seguir, cada disco é levemente pressionado para assegurar que haja contato adequado com o ágar. Dado que a difusão de alguns antimicrobianos é quase instantânea, os discos não devem ser removidos do lugar após o seu contato com a superfície do ágar.
f) Dentro de 30 minutos, as placas devem ser colocadas numa estufa, a uma temperatura constante de 35°C.
g) A disposição dos discos de antibióticos na placa deve respeitar o espaçamento mínimo de 2cm entre os discos e de 1,5cm entre o disco e a borda da placa, a fim de evitar interações antagónicas ou somatórias entre os diversos antimicrobianos.
h) As placas devem ser incubadas por um período de 16 a 20 horas. Embora leituras preliminares em tempos mais curtos possam ser realizadas, necessitam ser confirmadas nos tempos padronizados.
3.7 - Leitura das placas e interpretação dos halos de inibição:
a) O crescimento do meio de cultura deve ser semiconfluente. Se colônias isoladas estão presentes, o inóculo foi insuficiente e o teste deve ser repetido.
b) Medir, com uma régua milimetrada, o diâmetro de cada zona de inibição completa no centro do halo.
c) Os critérios de interpretação adotados («sensível», «resistente» e «intermediário») constante na tabela 1 foram desenvolvidos por correlação entre halos de inibição e concentração inibitória mínima (CIM), em testes de sensibilidade realizados em caldo e em ágar. Acham-se relacionados aos níveis efetivos em amostras biológicas.
d) O crescimento discreto em torno do disco de sulfa ou sulfa-trimetoprim, com formação parcial de halo, deve ser interpretado como sensibilidade.
e) O crescimento de colônias dentro do halo de inibição corresponde à colônias mutantes do microorganismo ou indica provável contaminação. É necessário repetir o teste.
f) A formação de leve camada do véu de Proteus spp dentro do halo de inibição deve ser desconsiderada, interpretando-se como sensível.
A) RESISTENTES: Organismos classificados como RESISTENTES, referem-se aqueles que não são Inibidos por concentração sistémica de um dado antibacteriano quando administrado nas doses usuais, ou quando caem nos limites onde os mecanismos de resistência microbiana são semelhantes (e.g., beta-lactamases) ou ainda que a eficiência clínica não tenha sido alcançada nos tratamentos estabelecidos.
B) INTERMEDIÁRIO: A classificação "Intermediária" deve ser informado. Ele geralmente indica que o resultado do teste foi impreciso ou indeterminado, ou ainda indica um limite de sensibilidade moderada, possível de um tratamento, desde que a droga se concentre no sítio da infecção (e.g., trato urinário). Se o organismo não for totalmente susceptível a um tratamento alternativo em determinado antibacteriano o teste deve ser repetido ou comparado ao teste de diluição seriada (CIM - Concentração Inibitória Mínima).
C) SENSÍVEL A classificação SENSÍVEL Induz o clínico a um tratamento onde o agente infeccioso pode ser apropriadamente combatido por um antibacteriano nas doses usuais recomendadas, a menos que por outros motivos seja contra-indicado.
3.8 - Antibiograma de organismos exigentes.
As provas com discos para Hoemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae e Streptococcus pneumoniae apresentam modificações em razão do crescimento lento de tais microorganismos, sendo necessário a adição de determinados elementos que intensifiquem o crescimento bacteriano.
a) Haemophilus influenzae : suplementa-se o Ágar Mueller-Hinton com sangue de carneiro a 5%, aquece-se até chocolatar e acrescenta-se o suplemento VX a 1% (Anexo 4). Prepara-se o inoculo a partir de colónias desenvolvidas em uma placa incubada durante 18 horas. O inoculo é preparado em caldo Mueller-Hinton e ajusta-se a suspensão com o padrão 0,5 da escala de Mac Farland.
As cepas sensíveis aos discos de ampicdlina apresentam zona maior ou igual a 20mm e as resistentes (produtoras de betalactamase) apresentam zona menor ou igual a 19 mm. As cepas resistentes a ampicilina são também resistentes a outras peniciinas. Os outros antimicrobianos seguirão critério de interpretação apresentado na Tabela 1.
b) Neisseria gonorrhoeae: utiliza-se o Ágar Base GC com 1% de suplemento VX ou equivalente sem hemoglobina (Anexo 4). Emulsionam-se as colônias provenientes de uma placa de ágar com 18 horas de incubação em caldo de Mueller-Hinton. Ajusta-se a suspensão com o padrão 0,5 da escala de Mac Farland. Prepara-se as placas de TSA, incubandoas em uma atmosfera de CO2.
As cepas produtoras de beta-lactamase exibem zona menor ou igual a 19mm ao redor de discos de penicilina de 10U. As cepas comumente sensíveis dão zonas de 30 a 60 mm. Para a espectmomicina emprega-se discos com a concentração de lOOmcg. As cepas resistentes apresentam zona de diâmetro menor ou igual a 14mm e as sensíveis apresentam zona maior ou igual a 18mm.
c) Streptococcus pneumoniae: utiliza-se o Ágar Mueller-Hinton com sangue desfibrinado de carneiro a 5%. O inóculo é selecionado de colônias bacterianas provenientes de uma cultura de 18 horas e preparado em caldo de Mueller-Hinton. Ajusta-se a suspensão com o padrão 04 da escala de Mac Farland. Inocula-se segundo o método estandartizado de Kirby-Bauer e aplica-se disco de oxacilina na concentração de 1 mcg. As cepas sensíveis à penicilina produzem zonas de inibição maior ou igual a 20mm de diâmetro. As cepas penicilina-resistentes ou relativamente resistentes produzem zonas de inibição menor ou igual a 19mm de diâmetro.
O disco de penicilina de 10U não deve ser testado para a sensibilidade do S. pneumoniae.
a) Com a finalidade de avaliar a precisão e a exatidão dos testes, utilizam-se culturas estoque de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), que devem ser testadas quando do preparo ou aquisição (compra) de cada lote dos discos, semanal ou quinzenalmente.
b) Para manter as culturas em estoque, recomenda-se o uso do ágar nutriente, (Anexo 4). As culturas devem ser mantidas no laboratório em triplicata em tubos vedados com parafina a uma temperatura de 4°C, e repicadas a cada controle.
c) Para testar as culturas, elas devem ser inoculadas em caldo, incubadas por a 18 horas, à 35°C, e depois semeadas em ágar, para então se obter colônias isoladas. Estas devem ser, então, repicadas e testadas de acordo com a técnica recomendada neste Manual. (Tabela 2)
d) As partidas ou lotes de Ágar Mueller-Hinton devem ser controladas em relação a concentração de timidina através de halo de sensibilidade do Streptococcus faecallis (ATCC 29212 ou ATCC 33186), cujo halo de inibição em relação ao disco de sulfametoxazol/trimetoprim deverá ser maior ou igual a 24mm. (Tabela 2)
Tabela 2 - CONTROLE DE QUALIDADE DE DISCOS
Limites estabelecidos para Controle de Precisão de Diâmetro de zonas de inibição (mm) em determinações individuais
e) Cada laboratório deve, sistematicamente, comparar o padrão de resistência atual com o das cepas isoladas da mesma espécie. Um padrão não usual pode estar correlacionado com a introdução de uma nova cepa no hospital ou provir de um erro de processamento. Cada possibilidade deve requerer investigação. Os testes com resultados duvidosos devem ser repetidos e quando necessário encaminhados para os laboratórios de referência para novos testes.
Na tabela 3 apresentamos uma proposta de padronização de antibiograma lembrando que cada hospital poderá realizar a sua padronização obedecendo peculiaridades próprias. A periodicidade desta padronização poderá ser anual e analisará o perfil de sensibilidade dos antimicrobianos já testados resultando na retirada daqueles com perfil de sensibilidade insatisfatório e adição de novos antimicrobianos, que a cada ano são anexados ao arsenal terapêutico.
TABELA 3 GRUPOS DE DROGAS SUGERIDAS PARA ANTIBIOGRAMA
* Quando houver isolamento de V. cholerae utilizar os discos de eritromiciana, tetraciclina, ampicilina, nitrofurantoina e pefloxacin.
** Mupirocin - disco isolado para casos de descolonização do Staphylococcus aureus(MRSA).
*** Para a confirmação da resistência instrínsica da oxacilina, os eslafilococos que no teste de Kirby Bauer foram resistentes, devem ser semeados em Mueller Hinton suplementados com 4% de NaCl e 6 ug de oxacilina/ml. Incubar por 24 a 35°C .
Nota - Em caso de uroculmras de pacientes internados, complementar a bateria de infecção urinária com a bateria de Gram negativos e Gram positivos, de acordo com a identificação bacteriana.
3.10 - Critérios para liberação do antibiograma:
Existirão dois grupos de antimicrobianos: Grupo l e 2.
Grupo 1: Antibiograma Básico: de acordo com a bateria utilizada, os antimicrobianos listados abaixo, são liberados no antibiograma para o médico assistente.
Sulfa/Trimetoprim, Cloranfenicol, Amoxitilina/clavulanato, Gentamicina, Amicacina, Cefalotina, Ceftriaxona, Ceftazidima, Cefotaxima, Cefuroxima, Tetraciclina, Penicilina G, Oxacilina, Eritromicina, Clindamicina, Rifampicina, Nitrofurantoína, Norfloxatina, Ácido Nalídixico.
Grupo 2: Antibiograma Suplementar: de acordo com a bateria utilizada, os antimicrobianos listados abaixo, são arquivados e liberados à C.C.I.H. do Hospital, não devendo ser emitidos rotineiramente junto com o antibiograma básico.
Imipenem, Ciprofloxacina, Aztreonan, Vancomicina, Teicoplanina, Mupirocin.
4 - COEFICIENTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
4.1 - Definição - é a relação percentual entre o número de culturas sensíveis de uma determinada bactéria a um antímicrobiano, e o total de culturas desta bactéria. Exemplo: Coeficiente de sensibilidade das cepas de E.coli.
Coeficiente de sensibilidade de E.coli à gentamicina = n° de culturas de e.colí sensíveis à gentamicina / Total de culturas de E.coli
4.2 - Cálculo e Interpretação do Coeficiente de Sensibilidade:
a) Realizar o cálculo do Coeficiente de Sensibilidade apenas para as cepas isoladas em pacientes internados (infecções hospitalares).
b) Preferencialmente utilizar culturas de uma mesma topografia, ou seja, determinar o coeficiente de sensibilidade de determinada bactéria a um determinado antibiótico, para cada sítio de infecção.
c) Excluir as culturas de repetição, a partir de uma mesma infecção. Se, no entanto, um paciente tiver mais de uma cultura pela mesma bactéria, porém, com perfil de sensibilidade diferente, passa-se a considerar esta como outra cultura para fins de levantamento epidemiológico.
d) Não calcular coeficientes de sensibilidade de espécies cujo número de culturas seja inferior a trinta, a fim de aumentar a segurança da análise estatística dos dados.
e) Para hospitais com pequeno movimento, recomenda-se a divulgação dos coeficientes de sensibilidade por períodos maiores de tempo (trimestral ou semestral).
f) Considerar no cálculo do Coeficiente de Sensibilidade as cepas de halo intermediário como resistentes.
A tabela para o cálculo do coeficiente de sensibilidade consta no anexo 3.
ANEXO 4
PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA
4.1 - MUELLER-HINTON ÁGAR (MHA) E MUELLER-HINTON CALDO (MHQ)
Desidratado - penar de acordo com a orientação do fabricante
(ingredientes por litro) MHA MHC
Ácido de casamino 17,5g 17,5mg
g/litro de solução 38g/l 21g/l
pH final a 25°C 73 ou- 0,1 7,4 ou- 0.2
Aquecer a quantidade indicada de água destilada, juntamente com o pó até a ebulição para que dissolva por completo.
Esterilizar em autoclave durante 15 minutos a 15 libras de pressão (121°C).
Distribuir o agar em placas em camadas de 4mm e o caldo em tubos conforme a necessidade.
Armazenar o meio pronto, embalado em sacos plásticos, durante 1 semana no máximo, à temperatura de 2 a 8°C.
Pesar de acordo com a orientação do fabricante usando o Muller Hinton Ágar como base.
Fazer a pesagem, colocar em um balão, homogeneizar bem, autoclavar por 15 minutos a 121°C, e deixar esfriar até 50°C.
Adicionar assepticamente o sangue desfibrinado de carneiro a 5%. O sangue Levar em banho-maria para chocolatar, deixar esfriar a 50°C e acrescentar o suplemento VX a 1% (lOml para cada lOOOml de meio).
Homogeneizar bem e distribuir em ramadas de 4mm em placas de Petri 100x20mm colocar o meio na estufa para teste de esterilidade.
Armazenar o meio pronto, embalado em sacos plásticos durante l semana no máximo, à temperatura de 2 a 8°C.
Pesar de acordo com a orientação do fabricante, usando o Muller Hinton Ágar como base.
Fazer a pesagem, colocar em um balão, homogeneizar bem, autoclavar por 15 minutos a 121°C, retirar e deixar esfriar a 50°C.
Adicionar assepticamente o sangue desfibrinado de carneiro a 5%. O sangue deve estar a temperatura ambiente.
Homogeneizar bem e distribuir em camadas de 4mm em placas de Petri de tamanho 100mmx20mm.
Colocar o meio pronto, embalado em sacos plásticos, durante 1 semana no máximo, à temperatura de 2 a 8°C .
Para estoque de cepas padrão ou isoladas em laboratório e que não tenham maiores exigências nutritivas.
Fazer a pesagem, colocar em becker, homogeneizar levar ao fogo até ferver, distribuir em tubos 13xlOOmm, colocando cerca de 4ml em cada um.
Inclinar quando sair do autoclave.
Armazenar em sacos plásticos, sob refrigeração entre 2 a 8°C.
OBS: Caso o Ágar Nutriente não contenha na sua formulação o NaCl, acrescentar na hora do preparo a uma proporção de 0,8%.
Fosfato de potássio dibásico 4g
Fosfato de potássio monobásico 1g
Fazer a pesagem, completar até 1000ml de água destilada ou deionisada e aquecer até ebulição para que se dissolva por completo.
Esterilizar em eutoclave durante 15 minutos a 121°C, retirar e deixar esfriar até 50°C.
Adicionar assepticamente o suplemento VX a 1% (10ml para cada 1000ml de meio).
Homogeneizar bem e distribuir em camada de 4mm em placas de Petri de tamanho 100mmx20mm.
Armazenar o meio pronto, embalado em sacos plásticos, durante 1 semana no máximo, à temperatura de 2 a 8°C.
ANEXO 5
ESCALA DE MAcFARLAND
Preparação
1 - Colocar numa série de 10 tubos, de diâmetro uniforme, 0,1ml, 0,2ml, 0,3ml, 0,4ml, etc até 1,0ml de uma solução a 1% de cloreto de bário.
2 - Completar os volumes para 10ml com uma solução a 1% de ácido sulfúrico, obtendo-se turvação crescente devida às diferentes concentrações de sulfato de bário.
O quadro abaixo mostra a correlação entre as turvações de sulfato de bário e a das concentrações de germes:
3 - Obter a suspensão bacteriana em caldo Mueller Hinton e comparar, em tubos de igual diâmetro, com os tubos da escala usando um papel de fundo branco com uma linha negra para contrastar esta turvação.
4 - O tubo usado para o TSA deve apresentar uma turvação equivalente a presença de 10 germes/ml, igual a obtida quando acrescenta-se 0,5ml de uma solução de Ba C12 0,048m (1,75% peso/volume) Ba C12 2H2O) a 99,5ml de H2SO4 0.36N (1% volume/volume). Esta turbidez é a metade da densidade do tubo n" l de Mac Farland e se chama padrão 03 Mac Farland.
5 - No caso de germes de crescimento lento em caldo como Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae e Streptococcus pneumonias, pode-se suspender colónias isoladas de um crescimento de 18 horas em caldo Mueller Hinton até obter-se a turvação acima mencionada.
BIBLIOGRAFIA
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Este texto não substitui o publicado no DODF nº 32, Suplemento, seção 1, 2 e 3 de 17/02/1994 p. 1, col. 1